Редактировать геном человека было слишком опасно. Новое открытие может все изменить

Метод направленного редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 был придуман и впервые испытан в лаборатории всего семь лет назад, в 2012 году. Обычно от появления концепта до реального применения проходят долгие годы, но не в этом случае: уже сейчас вопрос о возможности его применения на людях стал главным спором в научной повестке. Значительная часть экспертов считает, что технология пока слишком незрелая и не может гарантировать отсутствия опасных побочных эффектов. Этим летом дискуссия вокруг применения системы CRISPR/Cas9 на людях развернулась и в России. Генетик Денис Ребриков объявил о намерении использовать редактирование для устранения мутаций, вызывающих глухоту — и даже признался, что нашел для этого добровольцев. Почти сразу после этого в журнале Nature вышла статья, где описывается новая технология, в значительной мере основанная на той, что собирался использовать Ребриков, но потенциально значительно более безопасная с точки зрения побочных мутаций. «Медуза» разбирается с тем, что происходит с редактированием геномов прямо сейчас.

Год назад китайский ученый Хэ Цзянькуй объявил, что провел эксперимент по редактированию генома человеческих эмбрионов. На тот момент работы на человеческом материале «в пробирке» уже перестали быть сенсацией, однако Хэ признался, что его команда пошла дальше — эмбрионы с измененным геномом были не уничтожены, как в предыдущих экспериментах, а подсажены женщине. В результате на свет появились первые генно-модифицированные люди — близнецы Лулу и Нана. Результаты эксперимента, помимо того, что вызвали масштабную дискуссию о допустимости подобных экспериментов с этической точки зрения, также подтвердили, что эффективность технологии редактирования еще далека от идеала.

Хэ Цзянькуй использовал для редактирования человеческого генома систему CRISPR-Cas9 — «молекулярные ножницы» для ДНК, разработанные на основе белков бактериального иммунитета. Как признался ученый на генетическом конгрессе в Гонконге, попытка редактирования оказалась не совсем успешной. Хэ планировал воссоздать существующую в природе мутацию в гене CCR5, которая должна защищать своего носителя от ВИЧ. Однако анализ генома девочек показал, что система редактирования внесла мутацию — но не ту, что планировалось. Причина неудачи — особенности работы CRISPR-Cas9, которая в своей «оригинальной версии» может легко сломать имеющийся ген, но внести в него «правильные» изменения не так-то просто. Что сейчас с этими детьми неизвестно — власти Китая их скрывают.

Как работает CRISPR

На этой неделе в журнале Nature вышла статья с описанием новой технологии, которая могла бы помочь Хэ Цзянькую успешно провести эксперимент. Американские генетики модифицировали CRISPR-Cas9 и научили ее эффективно исправлять большинство видов мутаций, которые приводят к развитию болезней человека. Чтобы объяснить, в чем заключается новшество, вспомним сначала, как работает CRISPR-Cas9.

В основе системы лежат два компонента — белок Cas9, выступающий в роли «ножниц» для ДНК, и короткая молекула-гид, задача которой — направить «ножницы» в нужное место генома, где Cas9 мог бы сделать разрез. После того, как молекула-гид находит нужный участок, Cas9 разрезает обе цепи спирали ДНК. Затем, чтобы внести в геном нужное нам изменение, в систему надо добавить третий компонент — так называемую «заплатку», фрагмент ДНК с нужной последовательностью, которую системы ремонта смогут использовать как образец для починки хромосомы.

Важно подчеркнуть, что само по себе появление в ДНК двуцепочечных разрывов обычно рассматривается клетками как очень опасное событие, ведь оно чревато хромосомными перестройками или вообще запуском программы клеточного самоубийства — апоптоза. В каждой клетке поэтому эволюционно предусмотрена аварийная защита на случай таких разрывов (в природе они появляются, например, в результате действия радиации). Чаще всего при этом ферменты системы защиты просто находят и «склеивают» концы ДНК как попало. На месте разрыва тогда может появиться небольшая мутация в виде пропущенной (делеция) или вставленной лишней буквы (инсерция). Несмотря на то, что это вроде бы лишь точечное изменение, оно может приводить к полной поломке гена.

Одна из главных проблем с технологией редактирования в ее текущем виде заключается в том, что в клетках человека (в отличие от, например, дрожжей), точный ремонт на основе ДНК-образца — тот, на который рассчитывают ученые — идет с гораздо меньшей эффективностью, чем срочный, но неаккуратный аварийный ремонт. Именно поэтому у Хэ Цзянькуя не получилось отредактировать геномы близнецов так, как это было задумано.

Чем новый способ лучше старого

В своей новой работе исследователи из Гарварда под руководством Дэвида Лю (Liu) предложили новый способ внесения мутаций под названием праймированное редактирование. Принципиальное отличие от обычной схемы состоит в том, что в этом случае используется мутантная версия Cas9, которая способна резать только одну цепочку ДНК, не создавая опасного двуцепочечного разрыва. Для того чтобы залечить разрез и одновременно внести изменения в ДНК, ученые удлинили направляющую молекулу-гид и добавили в нее последовательность, которая выступает в роли образца для починки разрыва («праймер»). Одновременно к Cas9 пришили белок, который способен синтезировать ДНК на матрице РНК. В сумме получилась система, которая сначала надрезает ДНК и вставляет туда последовательность, закодированную в «праймере». После этого немодифицированная цепь ДНК разрезается тем же Cas9 и этот разрыв уже ремонтируется на основе последовательности второй цепочки.

Как показали авторы новой системы, эффективность точного редактирования составляет 10-50 процентов, при этом неаккуратный ремонт происходит на порядок реже. Второе преимущество праймированного редактирования перед базовой схемой — в несколько раз снижена частота нецелевых разрывов в геноме. Дело в том, что спаривание направляющей РНК с ДНК не всегда происходит на сто процентов точно, и в большом человеческом геноме она с некоторой вероятностью найдет себе еще одну, а то и несколько мишеней. Такое событие может привести к внесению мутации там, где их быть не должно. Ученые до сих пор спорят, насколько эти опасения существенны при использовании в клетках человека, но новая система в любом случае снизит риски нежелательных мутаций.

Чтобы показать потенциальную пользу праймированного редактирования, исследователи взяли клеточную линию и внесли туда несколько мутаций, вызывающих заболевания человека, а затем исправили их обратно. В эксперименте ученые справились с серповидноклеточной анемией, которая приводит к изменению формы эритроцитов, болезнью Тея-Сакса, а также сделали клетки устойчивыми к прионной инфекции. Авторы проанализировали базу данных вредных мутаций человека, которые ведут к появлению различных заболеваний, и заявили, что с помощью новой системы можно исправить 89 процентов из 75 тысяч вариантов.

Значит ли это, что наследственные заболевания скоро уйдут в прошлое благодаря генной инженерии?

Несколько дней назад в Москве прошла встреча, на которой специалисты в области биомедицины обсудили, насколько вмешательство на генетическом уровне реально необходимо для победы над болезнями.

Пресс-конференция была созвана по поводу приезда американского корреспондента из журнала Science Джона Коэна, который захотел лично пообщаться с последователем Хэ Цзянькуя — российским генетиком, заведующим лабораторией геномного редактирования Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Денисом Ребриковым.

Ребриков сообщил, что собирается провести подобный эксперимент для исправления на уровне эмбриона мутации, приводящей к наследственной глухоте. Для этого он даже нашел добровольцев — семейную пару, в которой оба родителя несут по две копии мутации. Впрочем, как рассказала изданию N+1 и впоследствии Science потенциальная мать генно-модифицированного ребенка, ее участие в проекте пока под вопросом — она опасается, что это может быть небезопасно.

В отличие от Хэ, Ребриков открыто заявил о своих планах и даже решил согласовать эксперимент в Минздраве. В России опыты с эмбрионами находятся в «серой» правовой зоне — они не запрещены напрямую, на что и надеялся ученый при планировании работы. Пока официальные органы не дали никакого ответа, но инцидент спровоцировал новую волну обсуждений в мировом научном сообществе.

Основные доводы оппонентов Ребрикова и Хэ заключаются в том, что для лечения многих генетических болезней внесение изменений в геном ребенка просто не нужно — даже безотносительно «сырости» технологии. Дело в том, что эксперимент по редактированию возможен только при применении экстракорпорального оплодотворения, когда зачатие происходит «в пробирке». Но если родители уже обращаются к ЭКО, почти всегда эмбрионы, несущие мутации, можно отсечь на этом этапе — без всякого редактирования, просто проведя генетический анализ получившихся эмбрионов.

Случаев, когда это сделать невозможно из-за того, что оба родителя несут по две копии мутантных генов (и появления здорового эмбриона просто невозможно), немного. Именно такую пару, страдающую наследственной глухотой, выбрал Ребриков, чтобы обосновать необходимость редактирования. Впрочем, его оппоненты полагают, что даже в таком случае поводов для вмешательства в геном недостаточно, потому что глухоту можно исправить установкой специального импланта.

Где будут применять новую технологию?

Надо заметить, что авторы новой статьи не предлагают начать исправлять геном эмбрионов. Кроме клеток зародышевой линии, изменение которых приведет к развитию полностью генно-модифицированного организма, можно вносить изменения в геном отдельных клеток — например, клеток крови. Эксперимент проходит ex vivo, то есть вне организма человека, после чего измененные клетки возвращаются обратно.

Споры ученых и специалистов по этике касаются в основном рождения людей с искусственно измененным геномом, в то время как против разработки способов терапии при помощи генно-модифицированных лимфоцитов никто особо не возражает. В своей статье в разделе обсуждение авторы нового метода как раз предполагают, что описанный эксперимент по лечению мутации, приводящей к серповидноклеточной анемии, можно использовать для исправления генома стволовых клеток крови и последующей трансплантации костного мозга в качестве терапии заболевания. Подобные способы терапии рака и ВИЧ — при помощи отредактированных клеток крови — уже проходят клинические испытания.

Тем временем, чтобы дать широкой аудитории представление о всех тонкостях и сложностях технологии CRISPR-Cas9, Netflix выпустил документальный фильм из четырех серий под названием «Неестественный отбор» (Unnatural Selection). Фильм, который стартовал 18 октября, расскажет о применении технологии не только для изменения генома человека, но и для изменения окружающей среды при помощи «генного драйва».